Differences

This shows you the differences between two versions of the page.

--- project:rendo:start [2025/04/09 19:26] – magn3zy
+++ project:rendo:start [2025/06/29 17:15] (current) – Protokol izolace gDNA Zea mays, využívané primery, optimalizace PCR, úprava získávání vcf souborů z EVA magn3zy
@@ Line 37: / Line 37: @@
 Dle referenční verze genomu //Arabidopsis thaliana// TAIR10 byly identifikovány vysoce konzervované oblasti genomu. Jako testovací geny byly vybrány geny ovlivňující dobu kvetení (FLC, FRI) a také geny z rodiny cytokinin dehydrogenáz/oxidáz (CKX1 - CKX7).
-Primery byly navrhnuty pomocí softwaru BLAST a dále byly analyzovány softwarem Primer3. Primery byly dále vybrány i s ohledem na podobné anelační teploty během PCR ke zmešení počtu prováděných PCR reakcí, všechny až na jednu vyjímku mají optimální anelační teplotu v rozmezí 50 - 53°C.
+Primery byly navrhnuty pomocí softwaru BLAST a dále byly analyzovány softwarem Primer3. Primery byly dále vybrány i s ohledem na podobné anelační teploty během PCR ke zmešení počtu prováděných PCR reakcí, všechny až na jednu vyjímku mají optimální anelační teplotu v rozmezí 50 - 53°C. Primery jsou zobrazeny v //Tab.// níže.
+^Název^Sekvence 5′‑3′^Chromozom^RefSeq pozice^PCR produkt^
+|FLC5‑F|ACAGAGACAACACAGAAGAGG|5|3 174 992|132|
+|FLC5‑R|ACAACCGTGCTGCTTTTGTT|5|3 175 104|--|
+|FLC35‑F|GGCAGTCTCAAGGTGTTCCT|5|3 175 198|472|
+|FLC35‑R|CTCTCCAGCCTGGTCAAGAT|5|3 175 650|--|
+|FRI2‑F|TCAAGTATCAAGCGTGGAATGC|4|270 369|184|
+|FRI2‑R|TGTGCAAGGGAAGGGTTCAT|4|270 533|--|
+|CKX13‑F|GGTTAAATGGATCAGGGTACTCTAC|2|17 315 739|328|
+|CKX13‑R|GCCAACGGTTGATTTGGAGC|2|17 316 047|--|
+|CKX42‑F|GGAAAAGGTGAAATGATGACTTGCT|4|14 567 352|120|
+|CKX42‑R|TGCATGATCCAACGCAATCC|4|14 567 452|--|
+|CKX33‑F|CGGACCTCGTTGACTGTGTAT|5|23 045 707|268|
+|CKX33‑R|AGGCCAAGTGGTTAAGGTTTCTA|5|23 045 952|--|
+|CKX512‑F|GAGCATCTCATCACCTATCCT|1|28 317 349|327|
+|CKX512‑R|CGTCCGACCGGATGAAATGT|1|28 317 656|--|
+|CKX73‑F|CGGACGGCTAAGATTTAATGAAGG|5|7 228 755|217|
+|CKX73‑R|TGGACCATTGACTCCGTTCT|5|7 228 952|--|
+Dle referenční verze genomu \textit{Zea mays} Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0 byly identifikovány vysoce konzervované oblasti genomu. Jako testovací geny byly vybrány geny EF1A, TB1, ADH, TGA1, HMGR1. Primery byly navrhnuty pomocí softwaru BLAST a dále byly analyzovány softwarem Primer3. V //Tab.// jsou všechny využívané primery zobrazeny.
+^Název^Sekvence 5′‑3′^Chromozom^RefSeq pozice^PCR produkt^
+|EF1A‑F|TGGGTTTTGCTGTTTTACAGATGG|—|—|990|
+|EF1A‑R|CGCGACAACTGCAAGGATG|—|—|--|
+|EF1AS‑F|TCATCATGAACCACCCTGGC|—|—|440|
+|EF1AS‑R|GTTCACGCGACAACTGCAAG|—|—|--|
+|ADH1‑F|AATACCACAGCTAAGGACGC|—|—|302|
+|ADH1‑R|GAGAGGGTGTGACTGACGTA|—|—|--|
+|TB1‑F|GCACAGCAAGATATGCACCG|—|—|853|
+|TB1‑R|AGCTCACGTTGAGGGAAAGG|—|—|--|
+|HMGR1‑F|TGACGCCTGTCTTTGACTCG|—|—|701|
+|HMGR1‑R|CACTGGCCTAGTATGGACGC|—|—|--|
+|TGA11‑F|CATCGCACCTCACACCTCTC|—|—|732|
+|TGA11‑R|ACAGGGACGAGCTACACTACA|—|—|--|
 ==== Materiál ====
-Jednotlivé rostliny //Arabidopsis thaliana// byly získány na polních lokalitách v Karlových Varech, Praze, Kladně a Křivoklátě v roce 2025. Z každé lokality bylo získáno 5 rostlin ze dvou míst v rámci okresu.
+Jednotlivé rostliny Arabidopsis thaliana a Zea mays byly získány na polních lokalitách v Středočeském a Karlovarském kraji. Z jedné lokality byly vždy vyizolovány 2 až 3 rostliny.
 === Izolace DNA ===
-Genomická DNA byla izolována za pomoci izolačního kitu Plant Genomic DNA Fast Kit (Mebep Biosicence, China) dle protokolu přiloženého ke kitu za využití mírných modifikací doporučených výrobcem:
+Genomická DNA //Arabidopsis thaliana// byla izolována za pomoci izolačního kitu Plant Genomic DNA Fast Kit (Mebep Biosicence, China) dle protokolu přiloženého ke kitu za využití mírných modifikací doporučených výrobcem:
   - Do zkumavky typu Eppendorf 1,5 ml bylo umístěno 100 mg rozmělněné tkáně.
@@ Line 56: / Line 94: @@
   - Do zkumavky byl přidán 1 ml 70% ethanolu a zkumavka byla několikrát promíchána a následně centrifugována 1 minutu při 12 000 rpm. Supernatant byl odstraněn a DNA byla nechána odvětrat.
   - Do zkumavky s DNA izolátem byl přidán Buffer DD a DNA byla uložena do -20°C pro dlouhodobé skladování.
+Genomická DNA kukuřice byla izolována pomocí klasické fenol-chloroformové metody pomocí předem připravených roztoků dle následujícího protokolu:
+    - Příprava CTAB lyzačního pufru: do kádinky nalejte 30ml deionizovené vody a přidejte: 1g CTAB; 4,09 NaCl; 0,6055g Tris; 0,372g EDTA. Roztok doplňte na celkový objem 50ml deionizovanou vodou. Upravte pomocí koncentrované HCL na pH 8.0. Zahřejte roztok na 65°C a promíchejte - roztok by měl být čirý.
+    - Příprava rehydratačního TE pufru: Do autoklávovatelné nádoby nalejte 100ml deionizované vody a přídejte 1,211g Tris a 0,372 EDTA. Roztok vyautoklávujte.
+    - Připavte si roztoky RNázy A a Proteinázy K v 1ml TE pufru v následující koncentraci: RNáza A 10mg/ml a Proteináza K 20mg/ml.
+    - Příprava roztoku fenol:chloroform:isoamylakohol v poměru 25:24:1 finální množství připravte dle počtu prováděných izolací - na jednu izolaci je třeba 800μl.
+    - Příprava roztoku chloroform:isoamylalkohol v poměru 24:1 finální množství připravte dle počtu prováděných izolací - na jednu izolaci je třeba 600μl.
+    - Do zkumavky typu Eppendorf 1,5 ml bylo umístěno 100 mg rozmělněné tkáně.
+    - K rozmělněným mladým listům přidejte 800μl CTAB lyzačního roztoku a 2μl Proteinázy K. Zvortexujte a 30 minut inkubujte při 65°C.
+    - Přidejte 800μl fenol:chloroform:isoamylalkoholu a 12krát invertujte. Centifugujte po dobu 10minut při 12 000rpm.
+    - Do nové zkumavky 1,5 ml typu Eppendorf přeneste přibližně 600μl vodné fáze a přidejte 1μl RNázy A a inkubujte 15 minut při 37°C.
+    - Přidejte 600μl chloroform:isoamylalkoholu invertujte 10krát a centrifugujte 5 minut při 12 000rpm.
+    - Přesuňte 500μl vodné fáze do nové zkumavky a přidejte 300μl isopropanolu. Invertujte 10krát a nechte 10 minut při pokojové teplotě. Poté centrifugujte 15 minut při 12 000rpm.
+    - Odstraňte supernatant a přidejte 1ml 70% ethanolu, krátce promíchejte a centrifugujte 5 minut při 12 000rpm.
+    - Odstraňte ethanol a peletu DNA nechte 5 minut odvětrat.
+    - Přidejte 50 až 100μl TE rehydratačního roztoku a nechte DNA rozpustit (při 70°C 30 minut; při 4°C přes noc) a poté skladujte při teplotě -20°C.
 ==== Testování amplifikace vybraných úseků ====
@@ Line 63: / Line 119: @@
 === PCR ===
-První kolo testování amplifikační schopnosti 12 párů primerů bylo provedeno pro 8 rostlin, vždy jedna z každé lokality. Všechny reakce byly provedeny v reakčním objemu 25 μl. Byla pro to použita DreamTaq polymeráza (Thermo Fisher Scientific, USA). PCR reakce byly prováděny pomocí termocykleru Thermo Hybaid PXE 0.2 (Thermo Electron Corporation, USA)
+První kolo testování amplifikační schopnosti 8 párů primerů pro //Arabidopsis thaliana// a 6 párů primerů pro //Zea mays// bylo provedeno pro vždy jednu rostlinu z každé lokality. Všechny reakce byly provedeny v reakčním objemu 25 ul. Byla pro to použita DreamTaq polymeráza (Thermo Fisher Scientific, USA). PCR reakce byly prováděny pomocí termocykleru Thermo Hybaid PXE 0.2 (Thermo Electron Corporation, USA).
-Druhá vlna testování amplifikační schopnost primerů zahrnovala dle konkrétního problému při žádné amplifikaci, či při vzniku nespecifických PCR produktů využití jiné DNA polymerázy. Využívána k tomu byla Pfu DNA Polymerase (GDSBio, China) a také Taq Plus DNA Polymerase (GDSBio, China) obsahující kombinaci vysoce specifické DNA polymerázy a také Pfu DNA polymerázy. Podmínky při kterých byly tyto PCR reakce prováděny jsou zobrazeny v //Tab.//.
+Druhá vlna testování amplifikační schopnost primerů zahrnovala dle konkrétního problému při žádné amplifikaci, či při vzniku nespecifických PCR produktů využití jiné DNA polymerázy. Využívána k tomu byla Pfu DNA Polymerase (GDSBio, China) a také Taq Plus DNA Polymerase (GDSBio, China) obsahující kombinaci vysoce specifické DNA polymerázy a také Pfu DNA polymerázy či FirePol DNA Polymerase (Solis BioDyne, Estonia). Podmínky při kterých byly tyto PCR reakce prováděny jsou zobrazeny v //Tab.//.
 ^Fáze           ^Teplota (°C)        ^Délka (s)  ^Počet opakování  ^
 |Predenaturace  |95                  |300        |1                |
-|Denaturace     |95                  |30         |30               |
+|Denaturace     |95                  |30         |33               |
-|Anelace        |50, 51, 52, 53, 58  |30, 45     |30               |
+|Anelace        |50, 51, 52, 53, 56  |30, 45, 60 |33               |
-|Elongace       |72                  |60         |30               |
+|Elongace       |72                  |60         |33               |
 |Postelongace   |72                  |600        |1                |
@@ Line 120: / Line 176: @@
 Nejdůležitější dílčí aplikací je aplikace RENDOVarPro. Zohledňující variabilitu z konkrétní referenční verze genomu a také variabilitu z dalších dostupných sekvenačních dat z GenBank. Uživatel zadá úsek který by pomocí PCR amplifikoval, název organismu, referenční verzi genomu, pozici indelu či SNV kterou chce analyzovat. Důležité je analyzované pozice zadávat s ohledem na referenční verzi genomu dle, které se pracuje pro stáhnutí správných a relevantních souborů. Pro přesnější analýzu je třeba zadat také číslo chromozomu. Dále musí uživatel zadat svůj email, tento email není nijak uchováván, slouží pouze jako parametr požadavku pro NCBI Entrez API, která dle emailu zajišťuje kontrolu dodržení počtu požadavků.
-Po vyplnění těchto údajů začne analýza nejprve stažením z NCBI databáze pomocí Entrez API referenční sekvence, dále jsou z EVA databáze staženy data o variabilitě zadaného úseku. Z těchto dat je poté vytvořen vcf soubor a také referenční sekvence zahrnující variabilitu z referenční verze genomu. Současně s tvorbou vcf souboru probíhá stažení relevantních dat z GenBank, alignment a vytvoření druhého vcf souboru. Tyto dva vcf soubory jsou následně spojeny a vytvořen je finální obsahující veškeré dostupné data o variabilitě v tomto úseku. Poté probíhá návrh vhodných restrikčních endonukleáz k analýze SNV. Uživatelské rozhraní RENDOVarPro aplikace je zobrazeno na obrázku níže. Samotná analýza probíhá různě dlouhou dobu. Způsobeno je to nutností limitovat počet požadavků v určitém časovém úseku pro využívané databáze. Pro úseky o délce do 600bp probíhá analýza do dvou minut. Pokud pro zjištění konkrétní variability neexistuje vhodný enzym je v poli pro výsledky zobrazeno hlášení „No enzymes found“.
+Po vyplnění těchto údajů začne analýza nejprve stažením z NCBI databáze pomocí Entrez API referenční sekvence, dále je z EVA databáze stažen celogenomický vcf soubor pro zadaný organismus a referenční verzi genomu. Z těchto dat je poté vytvořen vcf soubor zahrnující variabilitu z referenční verze genomu. Poté probíhá návrh vhodných restrikčních endonukleáz k analýze SNV. Uživatelské rozhraní RENDOVarPro aplikace je zobrazeno na obrázku níže. Samotná analýza probíhá různě dlouhou dobu. Způsobeno je to různou velikostí celogenomového vcf souboru a také rychlostí připojení k internetu. Pokud pro zjištění konkrétní variability neexistuje vhodný enzym je v poli pro výsledky zobrazeno hlášení „No enzymes found“.
 {{ :project:rendo:rendovarpro.png}}
 RENDOVarPro je však ještě stále vylepšována, nejdůležitějším úkolem je vytvoření vizualizace výsledků na gelu při štěpení konkrétním enzymem pro všechny varianty a rozšíření této dílčí aplikace o jistý manuální a polomanuální mód umožňující uživatelům více zasahovat do nastavení a parametrů hledání vhodných restrikčních endonukleáz. Po pilotních testech softwaru bude tento software celý dostupný na GitHub jako veřejný opensource nástroj.
+==== Restrikční analýza ====
+=== Arabidopsis thaliana ===
+Softwarem RENDOVarPro byly navrhnuty vhodné restrikční enzymy pro analýzu konkrétních SNV, jednotlivé úseky genů uvedených a štepených na obrázku byly tímto enzymem štěpeny dle metodiky.
+{{ :project:rendo:13_5_2025_combined_for_article.jpg?600 |}}
 ===== Licence =====
@@ Line 134: / Line 198: @@
 Tento projekt je ve fázi vývoje a není určen k veřejnému použití. Jakékoli šíření, kopírování, úpravy, prezentace nebo použití tohoto softwaru (ani jeho částí) bez výslovného písemného souhlasu autora jsou zakázány.
-Použití v akademických, výukových, komerčních i nekomerčních kontextech je momentálně nedovoleno.
+Použití v akademických, výukových, komerčních i nekomerčních kontextech není momentálně dovoleno.
 Autor si vyhrazuje právo změnit podmínky šíření, konkrétně zveřejněním projektu na GitHub přejde projekt pod licenci Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International (CC BY-NC 4.0).
@@ Line 165: / Line 229: @@
-===== Použité nástroje =====
+===== Poděkování =====
-MAFFT – Multiple Sequence Alignment Tool. MAFFT je dostupný pod BSD licencí. Více informací: https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/
-Citace: Katoh K, Standley DM. MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Improvements in Performance and Usability. Molecular Biology and Evolution, 2013.
+Ráda bych poděkovala zaměstnancům Katedry genetiky a šlechtění ČZU za možnost využívání jejich laboratoře a přístrojového vybavení, které zde není dostupné (spektrofotometr pro mikrolitrové objemy, restrikční endonukleázy).